L’ultimo dipinto della parete sinistra, iniziato dall’artista senese Alessandro Casolani e terminato dal figlio Ilario nella seconda metà del XVI secolo, rappresenta l’annuncio della nascita di Gesù alla Vergine Maria. Quest’ultima, raffigurata sulla sinistra, viene sorpresa dalla visita dell’Arcangelo Gabriele che la saluta porgendole un giglio bianco, segno di purezza, e, con la mano destra, indica la colomba dello Spirito Santo che appare tra le nubi. Sul pavimento, in primo piano è deposta una cesta con l’occorrente per cucire, mentre accanto alla giovane donna si trova un tavolo con un libro aperto e una clessidra. Quest’ultima indica che il disegno di Dio non si realizza in una dimensione astratta, ma nello scorrere del tempo. In un contesto quotidiano accade un fatto straordinario: Maria accetta di compiere la volontà di Dio e di divenire la Madre di Gesù. La ragazza, però, non nasconde il timore e la sorpresa di essere stata scelta dal Signore. Con la mano destra al petto sembra dire: “Proprio io?”.
Lo sfondo del dipinto è interrotto da una sorta di finestra nella quale, in precedenza, era collocato un altro dipinto.