L’episodio seguente, la Crocifissione, è stato dipinto nel 1502 circa da Pietro Perugino. La tavola, collocata sul secondo altare della navata, a destra, ritrae Gesù nell’ora della morte. Ai piedi della croce, oltre alle pie donne e a San Giovanni Battista, si individuano anche alcuni Santi agostiniani: Monica, la madre di Agostino; Agostino, il Santo patrono dell’Ordine e  Girolamo, padre del deserto, la cui presenza ricorda l’origine eremitica degli Agostiniani. A quest’ultimo è dedicata anche la tavola del barocco Astolfo Petrazzi, ubicata sul primo altare della navata, a destra. Al tema della Crocifissione, era connesso anche il ciclo di affreschi che decorava la cappella Piccolomini, di cui è sopravvissuta solo la Maestà del senese Ambrogio Lorenzetti, eseguita nel 1338. La presenza di Santa Caterina d’Alessandria nell’opera del Lorenzetti e nel suddetto ciclo pittorico, era collegata con il mistero della croce, tema caro anche agli Agostiniani. Infatti, nella disputa contro l’Imperatore, essa sosteneva che Cristo era morto sulla croce per salvare l’umanità dal peccato originale. Nel dipinto del Lorenzetti, sono presenti anche due Santi agostiniani: Antonio Abate e Agostino, che sotto l’abito vescovile indossa quello agostiniano. Egli ha in mano tre libri, perché secondo la tradizione, aveva redatto una regola per i canonici e gli eremiti, e due . . .