Il 12 marzo del 1326 con una solenne celebrazione fu posta la prima pietra della nuova e più grande chiesa di San Francesco, su disegno di due architetti senesi: Agostino di Giovanni e Agnolo di Ventura. La chiesa sorse nel luogo dove si trovava la precedente e più piccola chiesa francescana, che inizialmente fu preservata per poter continuare il regolare svolgimento delle celebrazioni religiose.
Dopo poco più di vent'anni dall'apertura del cantiere l'arrivo della terribile Peste Nera del 1348 colpì così profondamente la città, uccidendo oltre la metà della popolazione, da costringere all'interruzione dei lavori della chiesa di San Francesco, così come di altri cantieri cittadini. A quell'epoca probabilmente erano già state completate l'abside e le cappelle della crociera, che, come in ogni chiesa, erano i primi elementi ad essere realizzati, insieme all'altare. A questa fase di rallentamento dei lavori si possono far risale anche alcuni frammenti di affreschi che si conservano lungo la parete laterale destra della navata, rappresentanti la Visitazione, alcuni Santi e le Stimmate di San Francesco; alla stessa epoca (1370) risale l'affresco a falso polittico di Andrea Vanni, conservato nella cappella del Sacramento.
Nel 1407 il cantiere della chiesa fu nuovamente attivo, soprattutto per lavori di restauro necessari dopo il lungo tempo di noncuranza; è facile pensare che questo nuovo fervore costruttivo sia stato suscitato dalla presenza di San Bernardino da Siena, che lì viveva e sicuramente sognava di vedere conclusa la grande chiesa dedicata a San Francesco.
All'influenza di un altro grande personaggio senese, Papa Pio II Piccolomini, si deve l'inserimento della chiesa di San Francesco nella nuova cinta muraria della città realizzata nel 1473 e ancora oggi visibile nella valle scoscesa dietro l'abside. Pio II era legato profondamente alla chiesa francescana, infatti lì aveva fatto seppellire i suoi genitori e lui stesso aveva soggiornato nel convento dei frati minori. Nel 1475 l'edificio era terminato, anche se pochi anni dopo, nel 1482, il grande architetto, pittore e scultore senese
Francesco di Giorgio Martini fu incaricato di sopraelevare le pareti laterali per dare una maggiore proporzionalità al complesso; in quell'occasione l'artista realizzò anche lo splendido portale centrale, che attualmente si trova all'interno della chiesa, a sinistra dell'ingresso.
L'edificio attuale, seppure molto modificato nel corso dei secoli, presenta ancora l'impianto tradizionale delle tipiche chiese degli Ordini mendicanti: un'enorme e semplice aula unica, priva di colonne che ponendosi tra il predicatore e i fedeli avrebbero potuto distrarre questi ultimi dall'ascolto; al temine della grande navata si innesta il transetto, suddiviso in cappelle. La pianta è quella a croce egizia, la stessa della chiesa senese di San Domenico. Entrambi gli edifici, completamente costruiti in mattoni, sono la chiara esemplificazione di quello che era il messaggio degli Ordini mendicanti: non stupire con lo sfarzo, ma muovere gli animi con la parola e l'esempio.