Alcuni degli splendidi dipinti custoditi nella Basilica testimoniano la venerazione di San Francesco e dei suoi frati, e quindi anche di Bernardino e degli Osservanti, per la Vergine Maria, Madre di Dio.
Nella prima cappella a sinistra si trova la Madonna col Bambino e angeli, realizzata intorno al 1455 da
Sano di Pietro, prolifico artista senese caratterizzato da una straordinaria padronanza del disegno e dell’uso del colore. Il piccolo Gesù, teneramente aggrappato al manto della Madre, tiene in mano un frutto, molto probabilmente una mela, simbolo della sua vittoria sul peccato originale, ottenuta attraverso la sua morte e resurrezione; alla Passione di Cristo alludono anche la veste rossa del Bambino e lo sguardo triste e assorto della Vergine.
Alla mano dello stesso artista si deve anche la pala collocata sull’altare della terza cappella a destra, raffigurante la Madonna col Bambino tra San Bernardino e San Girolamo, eseguita dopo la metà del XV secolo. Come nell'opera appena osservata, è ben evidente un rimando al tema della Passione, rappresentato in questo caso dal cardellino che stringe in mano Gesù: la leggenda narra infatti che l’uccellino si fosse punto mentre estraeva dalla fronte di Cristo crocifisso le spine della corona, macchiandosi col sangue del Salvatore; da allora in avanti le piume del suo capo sarebbero rimaste di colore scarlatto. Rosso è anche il raffinato drappo che ricopre il trono su cui siede la Vergine, il cui volto ricalca la mestizia notata nella pala precedente. A destra della Madonna si trova San Bernardino, emaciato per la penitenza, con in mano la tavoletta che egli era solito mostrare durante la predicazione, oggi conservata nella vicina sala del Museo. A sinistra è raffigurato invece San Girolamo, Dottore della Chiesa e primo traduttore della Bibbia, modello di sapienza cristiana, grande eremita e penitente; visse per lunghi anni nel deserto, dedicandosi alla preghiera, all'astinenza e allo studio. Gli scritti ascetici del Santo erano ritenuti particolarmente consoni alla riforma della Regolare Osservanza, tanto che a Girolamo vennero intitolati eremi e luoghi devoti dell'Ordine.
La terza pala di soggetto mariano, conservata nella quarta cappella a destra, non venne in realtà realizzata per la Basilica, ma per la soppressa chiesa di San Maurizio a Siena. Nel 1822 l'opera passò all'Osservanza, al fine di reintegrare le spoliazioni subite dal convento durante le soppressioni napoleoniche. Lo straordinario trittico raffigura la Madonna col Bambino tra i Santi Ambrogio e Girolamo e fu eseguito nel 1436 da un artista noto con il nome convenzionale di 'Maestro dell'Ossevanza', oggi identificato da diversi studiosi con lo stesso
Sano di Pietro nella sua attività giovanile. Risultano disperse alcune parti della carpenteria, mentre la predella, raffigurante la crocifissione di Cristo e due scene della vita di Ambrogio e Girolamo, è conservata presso la Pinacoteca Nazionale di Siena.
A differenza delle due opere precedenti, il Bambino tiene in mano un cartiglio con l'iscrizione Ego Sum, rivelando la sua divinità; Maria diventa così immagine della Chiesa che mostra Gesù agli uomini, affiancata da Ambrogio e Girolamo, due dei Padri della Chiesa Occidentale, figure che con gli scritti, la predicazione e la vita influirono in modo significativo sul cammino della Chiesa dei primi secoli. Il valore ecclesiologico della pala è confermato dalla presenza, nella cuspide centrale, del Cristo benedicente e, ai lati, dai Santi Pietro e Paolo, prìncipi degli Apostoli. Al di sopra, nei due medaglioni, sono raffigurati l'angelo annunciante e la Madonna annunciata: una volta completa di predella, la pala avrebbe rappresentato, ad una lettura verticale dall'altro verso il basso, il mistero di Cristo attraverso l'annunciazione, l'incarnazione e la crocifissione.