Le 12 Mars 1326 par une célébration solennelle la première pierre de la nouvelle et plus grande église de saint François est posée; les plans en sont de deux architectes siennois, Agostino di Giovanni et Agnolo di Ventura. L’église est construite à l’endroit où se trouvait l’église précédente, plus petite, qui au début est préservée pour que le déroulement régulier des célébrations religieuses puisse continuer.
Après un peu plus de vingt ans depuis l’ouverture du chantier l’arrivée de la terrible Peste noire de 1348 frappe durement la ville, tuant plus de la moitié de la population. Les travaux de la construction de l’église sont interrompus comme d’autres chantiers en cours dans la ville. Probablement à cette époque l’abside et les chapelles de la croisée des transepts étaient déjà terminées, ainsi que l’autel, comme dans beaucoup d’églises. Quelques fragments de fresques conservés le long de la paroi latérale droite de la nef, remontent à cette phase de ralentissement des travaux; il s’agit de la Visitation, de quelques Saints et des Stigmates de saint François. La fresque en faux polyptique d’Andrea Vanni conservé dans la chapelle du saint Sacrement remonte à la même époque (1370).
Le chantier de l’église reprend son activité en 1407, surtout pour une restauration rendue nécessaire après une longue période de négligence; il est aisé de penser que cette nouvelle ferveur constructive ait été animée par la présence de saint Bernardin de Sienne, qui vivait là et qui très probablement rêvait de voir terminée la grande église dédiée à saint François.
On doit à l’influence d’un autre grand personnage siennois, le pape Pie II Piccolomini, l’inclusion de l’église de saint François dans l’enceinte des nouveaux murs de la ville, réalisée en 1473 et encore visible dans la vallée escarpée derrière le chevet. Pie II était profondément attaché à l’église franciscaine; en effet, il y avait enterré ses parents et lui-même avait séjourné dans le couvent des frères mineurs. En 1475 l’édifice est terminé, même si quelques années plus tard, en 1482 le grand architecte, peintre et sculpteur siennois
Francesco di Giorgio Martini est chargé de surélever les parois latérales pour donner de meilleures proportions à l’ensemble. A cette occasion, l’artiste réalise aussi le splendide portail central qui se trouve actuellement à l’intérieur de l’église, à gauche de l’entrée.
L’édifice actuel, bien que modifié au cours des siècles, présente encore le plan traditionnel des églises des Ordres mendiants : une nef unique, vaste et simple, privée de colonnes qui s’interposent entre le prêcheur et les fidèles, et qui pouvaient distraire ces derniers. Au bout de la grande nef, se greffe le transept, subdivisé en chapelles. Le plan est en croix égyptienne, le même que celui de l’église siennoise de saint Dominique. Les deux bâtiments, complètement construits en briques, sont une exemplification claire de ce qu’était le message des Ordres mendiants : ne pas étonner par le faste, mais émouvoir les esprits, par la parole et l’exemple.